0: Здравствуйте, уважаемые коллеги. Итак, мы с вами в течение нескольких занятий рассмотрели такой метод исследования, как электрофорез, но теперь пришло время перейти к новой теме, и лично мне она

1: Интересно, я надеюсь, что интересна она и вам. Эта тема посвящена Такому методу исследования, как полимеразная цепная реакция. Точнее, даже не метод исследования. Это, в общем то, инструмент, который появился относительно недавно, но сегодня стал чрезвычайно важным и чрезвычайно

2: Популярным в лабораторной практике и, в общем то, стал рутиной в лаборатории молекулярной биологии. Но прежде чем говорить о том, что же происходит и как реализуется этот метод, надо сделать небольшой днковой ликбез, то есть

3: Посвятить некоторое время тому, чтобы поговорить о том, что же такое в конечном итоге, а может быть в самом начальном, что же такое днк и каким же образом осуществляются процессы, связанные с днк в организме, и как эти процессы потом

4: Переносится в искусственную систему, где осуществляется как раз это самое пцр. Итак, давайте начнём, начнём мы с весьма дурно пахнущего начала. Оно связано с таким человеком, как фреде мишер, в общем,

5: То у него, как и у многих людей, в 19 веке, занимавшихся наукой, у него была нормальная специальность, он был врачом, но параллельно вот занимался исследованиями и 1 из объектов его исследования были бинты пропитанные

6: Гноем, который ему поставляли из больницы, работал он в лаборатории, которая была оборудована в Холодных подвалах замка хоэн тюбинген, где, очевидно, выполняет достаточно.

7: Длительные эксперименты. Он получил вещество и в 1869 году опубликовал статью об этом веществе, названном нуклеин. Итак, в 1869 году было открыто вещество, которое мы сейчас с вами знаем как нуклеиновые

8: Кислоты. Хотя этот термин кислоты появился ещё при жизни самого мишера, но он крайне категорично, крайне отрицательно относился к этому понятию. То есть утверждал, что кислотой, что термин кислота здесь не применим, но тем не менее,

9: Этот термин прижился, и мы его сейчас используем. Как вы видите, сам мишер назвал это вещество нуклин, мы с вами знаем, в общем то, сейчас, что это, в общем, по сути, основной носитель генетической информа.

10: Может быть, можно сказать, единственный носитель генетической информации для живых организмов, но это только для нас. С вами сейчас очевидно, на самом деле только лишь спустя, где-то примерно 40 лет после.

11: Смерти мишера, а значит, от, если отсчитывать от времени открытия, прошло времени ещё больше, да, только спустя какое-то время стало понятно, что именно днк отвечает за хранение и перенос генетической информации. До этого, счита,

12: Казалось, что она слишком простая по своему строению для того, чтобы выполнять такую сложнейшую фундаментальную функцию, и большинство учёных склонялось к мысли, что все-таки за это отвечают белки да, мы с вами увидели, что электрофорез днк.

13: На самом деле более простой по своей методологии, чем электрофорез Белков. Но вот тем не менее, в данном случае природой выбрана именно молекула днк как наиболее оптимальная для выполнения такой важнейшей функции. Итак, все-таки

14: И днк отвечает за эту процедуру. Да, это было доказано в классических опытах, авторами которых стали эвери, маклауд и маккарти. И эти опыты заключались в том, что

15: Они, ну, я сейчас открою 2, мне кажется, это более понятный рисунок. Они использовали в качестве подопытных объектов мышей и причём вводили этим мышам, если вы

16: Смотрите, на, значит, в данном случае, да, они использовали в качестве вводимых мишам биологических агентов пневмококки, клетки пневмококков. Причём использовали как болезнетворные, так,

17: Так и не болезнетворные логично предположить, что при введении в клетки в организмы мышей болезнетворных пневмококков мыши благополучно, ну, точнее, весьма злополучно для них, конечно, но тем не менее они погибали при введе.

18: В организм уже не болезнетворных пневмококков этого не происходило. Соответственно, при кипячении болезнетворных, то есть, соответственно, при этом достигалась гибель всех клеток.

19: Да, они получали мёртвые клетки, которые смешивались с неё болезнетворными пневмококками, живыми, очевидно, и вводили в организм мышей, и обнаруживали в результате этого эксперимента, что мыши все равно погибали. То есть

20: Условия, которые приводили, в общем то, к изменению состояния Белков, к их вентура ии разрушению и так далее, не исключали, да, в данном случае, во первых, отрицательное воздействие на организм.

21: Раз и во вторых, они каким-то образом это, это отрицательное воздействие передавалось, способность оказывать отрицательное воздействие, передавалась от мёртвых болезнетворных пневмококков живым, не болезнетворным соответственно, вот в общем то уже было известно

22: О переносе нуклеиновых кислот между клетками и поэтому был сделан вывод о том, что именно днк, которая переходила из клеток не болезнетворных.

23: Точнее, из клеток болезнетворных в клетки не болезнетворных пневмококков, что именно это днк и, по сути, и являлась носителем той информации, той генетической информации, которая управляет развитием всех живых организмов, и, естественно, их.

24: Воздействием на окружающую среду, как мы имеем ввиду, как мы видим, в данном случае, соответственно, ранее проводились химические исследования. Уже сам Миша установил, что состав нуклеиновых

25: Кислот входит углерод, азот, водород и фосфор более поздние исследования альбрехта касселя показали, что на самом деле эти атомы входят в состав следующих элементов, да, то есть он брал нуклеиновую кислоту, подвергал её гидро.

26: И получал в качестве продуктов этого процесса смесь из 4 веществ, которые с тех, которые, в общем то, называются с тех пор азотистыми основаниями. Это Аденин, цитозин, Тимин, гуанин, они так

27: У нас выделено с вами на отдельном тёмном фоне и урацил их 5. В конечном итоге было получено. Кроме того, образуется фосфорная кислота и какой-то сахар на тот момент.

28: Ещё выявлять, идентифицировать сахара на тот момент не получилось немножко позднее это сделал учёный по фамилии Левин или Левин, к стыду своему, не могу точно сказать, как верно.

29: В данном случае звучит, но он установил, что Сахаров 2, 1 из них это айбода. И установил он это в 1911 году, a2 дезокси абоза, что было установлено только в 1000

30: 930 году. Соответственно, в связи с этим и получается, что та нуклеиновая кислота

31: В состав которой входит рибоза, называется рибонуклеиновой кислотой, а та нуклеиновая кислота, в состав которой входит днк, называется дизоксирибонуклеиновой кислотой. Ну и кроме того, если мы вернёмся к предыдущему слайду, вот эти 4

32: Азот их основания Аденин, цитозин, Тимин и гуанин являются составными частями днк, а урацил вместе с 3 из них входит в состав рнк. Итак.

33: Двинемся дальше, что мы с вами имеем? Нуклеиновая кислота это полинуклеотиды, и мы с вами уже как-то об этом говорили. В данном случае надо помнить, что любой нуклеотид состоит из вот этой самой фосфорной кислоты, сахара и какого-то 1

34: Азотистого основания, да. Ну, например, вот рыбы нуклеотид состоит из рибозы остатков фосфорной кислоты и азотистого основания Аденина. Кстати, по моему, формула его здесь не совсем верная, нет кратной связи.

35: Вот в этом цикле или дезоксинуклеотидов, соответственно, здесь дезокси Бо остаток фосфорной кислоты и опять же не совсем верная запись.

36: Не совсем верная запись азотистого основания. Ну, давайте исправим эту оплошность, которая в данном случае имеет место быть. Благо возможность у нас такая есть. Будем

37: Максимально честны.

38: С собой. Итак, кажется, если я правильно помню, то нам надо здесь ещё 1 связь нарисовать, здесь нарисовать связь, здесь связь. И здесь вы помните, что художник из меня не очень, но тем не

39: Не менее как есть. Соответственно, когда эти нуклеотиды объединяются в цепочку, мы получаем полинуклеотид или нуклеиновую кислоту. В данном случае это изображена дизоксирибонуклеиновая кислота. Видите?

40: Азотистое основание сахар, остаток фосфорной кислоты, азотистое основание, сахар, остаток фосфорной кислоты, что здесь очень важно помнить, что у любой молекулы нуклеиновой кислоты 2 конца 5/2 и 3/2.

41: Конец ну, если для себя попытаться запомнить, то нуклеотид, который находится на 5/2 конце нуклеиновой кислоты, оканчивается фосфорной кислотой, а нуклеотид, который стоит на 3/2 конце оканчи.

42: Сахаром если кому-то интересно более глубоко, то причиной этого является следующая особенность.

43: Те, кто знакомы со строением Сахаров, знают, что вот это вот колечко, которое в данном случае лежит в основе дезокси бозы, да, вот здесь, в углах, находится на самом деле атом углерода. Причём вот этот атом углерода

44: 1, 2, 3, 4, 5. Мне кажется, стало вполне понятно, почему 5/2. Потому что здесь крайним атомом углерода является 5. Ну, а здесь

45: Штрих, потому что крайним атомом углерода, который связывается, на которым все заканчивается, это 3 атом углерода. Поэтому и Штах конец. Двигаемся дальше. Соответственно, в дальнейшем, когда было уже известно об азотистых

46: Основаниях Эрвин черга занимался многочисленными исследованиями нуклеиновых кислот, выделенных из разных организмов, и он установил, что какой бы организм живой организм он бы не взял, всюду наблюдалось.

47: Отношение, что количество Аденина равно количеству Тимина, количество гуанина равно количеству цитозина, ну или что естественно, логично, что сумма азотистых оснований Аденина гуанина равна сумме азотистых.

48: Основании Тимина и цитозина. В общем то, он то сделал открытие в 1950 году. И после этого 52 года, наверное, считал, что, в общем то, вернее не наверное, а известно, что он считал, что это базовое открытие для, вообще, для установления строения молекулы.

49: Днк, соответственно, но он не смог воспользоваться до конца этой информацией. За него это сделали учёные, которых, фамилии которых, вероятно, известны вам. Это джеймс уотсон и фрэнсис каик, да, кото

50: Которые собрали воедино и информацию, которую, которой обладал черга, и информацию, которую давали уже на тот момент существующие методы исследования, такие как рентгеноструктурный, допустим, анализ, что они установили, они

51: Взяли правило черга а и сказали, что это может быть только в том случае, если молекула днк устроена так, что Тимин каким-то образом контактирует с аденином, а цитозин контактирует с гуанином. Они назвали это

52: Принципом комплиментарности, то есть в любой молекуле днк, молекула расположена таким образом, чтобы образовывались такие пары оснований, в каком случае это может быть. А только в 1. Значит, молекула днк на самом деле состоит из 2 параллельно.

53: Размещённых молекул, что интересно, выдвигая на тот момент эту гипотезу. 2 весьма молодых учёных противопоставляли свои результаты выводам, которые к тому времени сделал уже очень известный и

54: В мире, принимаемый как авторитетный учёный лайнус полинг, который на самом деле предлагал молекулу, состоящую из 3, то есть спираль, состоящую из 3 молекул днк. А вот они выдвинули такую гипотезу, что

55: Интересно, 1 из инструментов, который они использовали, это, по сути, конструктор. Они заказали в у, значит, любой научной лаборатории. У любого серьёзного научного научной организации есть

56: Отдел, который занимается изготовлением, ну, всего, что понадобится. Вот, соответственно, они заказали элементы конструкторы, эти элементы по сути своей, по сути своей, с помощью этих конструкторов.

57: Были собраны остатки сахара. Вот, видимо, здесь вот как раз остаток дезокси боза, азотистое основание, что они делали? Они собирали различные варианты молекул днк таким образом, чтобы полученная

58: Конструкция в наибольшей степени соответствовала имеющимся на тот момент представлениям о этой замечательной молекуле. То есть они собирали конструктор, который в лучшем наилучшим образом описывает ту ситуацию, которая была в тот момент в научном мире, и

59: Действительно, вот этот вот принцип комплементарности, когда азотистые основания взаимодействуют парами, Аденин, Тимин, гуанин, цитозин, да, в конечном итоге вот они предложили именно такую конструкцию и сейчас

60: Мы с вами знаем, что такая, такая молекула днк, в общем то, является наиболее каноничной, наиболее широко распространённой. Это не значит, что такая конструкция единственная на самом деле есть отклонения от вот такой канонической структуры.

61: Но, тем не менее, для нас с вами достаточно понимать, что есть хотя бы такая. Тем не менее надо помнить, что 2 этих действительно

62: Действительно, выдающихся учёных. 1 из них сейчас здравствует. По крайней мере, вот на момент записи этой лекции, надеюсь, здравствовать ещё будет достаточно долго, но действительно весьма печально, что для большинства людей

63: На слуху только эти 2 фамилии. Во первых, когда они получили нобелевскую премию в 1962 году вместе с ними эту нобелевскую премию за эту же это же открытие получил и морис уилкинс, он был 1

64: Из тех, кто предоставил уотсону и крику необходимый набор экспериментальных данных, которые они и сопоставляли со своим конструктором, можно так сказать, и, кроме того, с морисом уилкинсом работал.

65: Была ещё и Розалин франклин. Все считают, что она тоже должна была получить нобелевскую премию. Но если вы посмотрите даты выдачи этой премии вручения, точнее, и даты жизни, вы увидите, что Розалин франклин умерла. Зачёт.

66: Года до вручения нобелевской премии по физиологии, медицине, она скончалась от рака, а, как известно, посмертно нобелевские премии не дают. Поэтому вот и лауреатов в данном случае было трое, как я сказал,

67: Сказал вам 1000 в 1950 году Эрвин черга открыл, значит, своё вот своё правило черга а, да, через 12 лет получили нобелевскую премию уотсон, рейк и wilkins, но до конца жизни.

68: Умер черга в 2002 году. Он утверждал, что нобелевскую премию должен был получить он. Не знаю, вместе ли с ними или отдельно, но он считал, что его открытие является наиболее базовым. В данном случае не спорю, но тем не

69: Менее. История распорядилась именно так. А теперь поговорим о том свойстве днк, которое для нас в данном случае наиболее интересно. Это способность к удвоению. Я вам предлагаю познакомиться с этим материалом на видео на английском.

70: Языке. Потом я дам свои комментарии. Ну соответственно, если кто у кого-то из вас есть соответствующие знания языка, замечательно, а если у кого-то нет, но может быть это будет стимулом к тому, чтобы немножко поднять свой уровень английского. Так

71: Извините, сейчас попробую запустить с like the про Кола селс репликейшен селс квикли энд эфишент ли of the process of a sexual reproduction.

72: Is there to make a winner репродюс бай ба вижн, он the first со?

73: Il ну, future generation we have the same жене a the the the speed a replication дабл из the палумер.

74: Ту на вич, а банде ту и ту форма дабл хиликс.

75: The консист оф the basie the words consist of her and groups.

76: Basis, инклуд, син Фанин, эдмин эннин син 3, with Ганин, энд Саймин, формс, ту, хандрид, йен, банс, виз, админ, зис, из.

77: Tu as the double Вил хэв н in a five прайм ту фри прайм дирекшн ту the hi group of the ending.

78: Free, прайм, ту, файв, прайм, дирекшен, пока что все the the the a репликейшен, ту би executioner.

79: Ich молекул из in the н. Репликейшен Бегин из b and each ориджинал стренд стенд из.

80: Them for the complimentary но to make two н е репликейшен экор inn, the fire to фри прайм дирекшен эс ту зе фри прайм n of the.

81: Репликейшен ви биг специфик оф зе джин репликейшен зе ориджин оф репликейшен ноут офи, репликейшен кол.

82: The replication фор.

83: In order андестенд хау комплекс a this first стадии репликейшен ИНН моделс, лайк Иколай.

84: Number of anna are needed for репликейшен ту пресид ванте репликейшен форк из эстаблиш.

85: The of the double and single байндинг, сингл, ридженс джай, рейс из u two me the double of the репликейшен фо.

86: Do not super Ван репликейшн фо стейбл-ка the edition of new twice to the growing н other in such is and the camp хелп the.

87: In place праймер хэв ту би ту зе.

88: Праймер репликейшен оф Бо стрен эт the same time Ван юзинс энд и он synthesis экор он the фри прайм ту файв прайм.

89: Виффер ту c. The leading стренд.

90: New to the фри прайм n. Не expand репликейшен фо и synthesis её on the p. Hey two three прайм колд зе.

91: And is completed in сегмент колд, оказаки, фрагментс.

92: Репликейшен он the pride прайм, а the five прайм, n of the strand.

93: Dna полимире 3 the shot сиквенс оф nuclear there оказаки фрагментс ту зе праймер филинг ин зе гэб.

94: Age the хиликс из open Фезер зис процесс репит энн тул дентар стренд из репликейт.

95: Палимой Ван реплейс из the праймер виза n u two энну Бандин земент энд зетта.

96: Replication ту кал of the press of passion Лаус Ван бактериал селс ту мейк Шор ол дер селс have the same genetic констракшен.

97: Он to function in the same мне териал Алёну ни of individuals in a colony.

98: Итак, мы с вами познакомились с таким анимированным, анимационным представлением процесса эпликации на примере достаточно простого и широко используемого модельного организма, как

99: Кишечная палочка e. Coli да, в общем то, я прошу прощения, что очень часто использую видеоматериалы с на английском языке это всего лишь является следствием того, что я подбираю, на мой взгляд, наиболее.

100: Понятный с точки зрения визуального ряда материалы. Ну, кроме того, я надеюсь, что это будет стимулом для того, чтобы вы улучшили свои знания именно в английском языке, поскольку для того, чтобы более глубоко знакомиться с достижениями науки,

101: Необходимо изучать не только русскоязычные, но и иностранные источники, а, как вы знаете, языком международного научного общения естественно, является английский язык. Какой вывод мы с вами можем сделать из всего этого видео список действующих лиц?

102: Этого, ну, на мой взгляд, 1 из наиболее величайших представлений, которое имеет место быть в живых системах репликации днк. Список участников огромен. И на самом деле мы не ставим с вами себе цель.

103: Познакомиться, изучить их. Все мы с вами не изучаем сейчас молекулярную биологию и не пытаемся понять глубоко все эти процессы нам необходимы. Некоторые из них, некоторые из этих участников. Но тем не менее, давайте

104: Какие-то комментарии тому, что мы увидели с вами дадим. Итак, что нас с вами, что нас с вами здесь будет интересовать? Ну, во первых, ключевым, наверное, все-таки ключевым участником процесса является фермент, название которого днк полимераза в данном случае

105: Вот элемент днк полимеразы этот фермент это фермент, который осуществляет синтез, в общем то новых молекул днк, которые являются комплементарными материнским

106: Материнской, да, но для того, чтобы это произошло, необходимо что-то сделать с самой исходной материнской молекулой днк. Если мы с вами вспомним, да, то даже наших представлений достаточно для того, чтобы знать о том, что молекула днк

107: Состоит, значит, из 2 цепей, которые обе, которые закручены вокруг 1 оси, да, в виде такой двойной спирали, для того, чтобы вообще процесс, процесс действия, полимеразы, процесс аппликации оказался

108: Возможен. Для этого. Во первых, молекула днк должна раскручиваться, то есть спираль должна раскрутиться, a2 цепочки, которые образуют эту самую молекулу днк, должны расходиться. Вот за это отвечают. Вот эта группа ферментов это top.

109: Miralza, днк праймаза и днк хеликаза. Вот 2 этих этих фермента, которые в конечном итоге отвечают за этот процесс. Итак, они в конечном итоге они делают молекулу днк раскрученной и

110: И, так скажем, распаянные, что ли, когда 2 цепочки отходят друг от друга и становятся доступными для днк полимеразы, теперь, что очень важно, что 2 цепи.

111: 2 материнские цепи да, синтез комплементарных их новых, комплементарных им новых молекул днк происходит по разному. 1 из синтезируемых цепей, она синтезируется быстрее.

112: То есть вот эта новая молекула днк, которая в данном случае синим показана, она синтезируется быстрее, чем 2, называется лидирующая. И особенность её в том, что она синтезируется без каких-либо разрывов. То есть

113: Она синтезируется по ходу движения полимеразы по молекуле днк, по материнской, без всяких разрывов. 2 цепь называется запаздывающая, и она, как мы понимаем, с вами, синтезии.

114: Медленнее, значит, запаздывающая цепь у нас с вами здесь показана красным. Это новая синтезируемая цепочка днк, которая комплементарна старой материнской. И в чем особенность? Особенность её в том, что она

115: Синтезируется не не без перерывов.

116: Как случай лидирующий, а небольшими фрагментами, фрагментами оказаки соответственно, эти фрагменты оказаки синтезируются отдельно друг от друга и потом только соединяются с помощью фермента.

117: Называемого днк лигазы, что важно понимать, что вот этот процесс, который осуществляется помимо того, что он не может происходить без ферментов, вот они, лигазы.

118: Праймаза, топоизомераза, днк хеликаза. Помимо этого, этот процесс не может происходить без таких важнейших участников, как праймеры, праймеры. Ну, в общем то это очень маленькие по своей

119: Длине небольшие, это очень небольшие фрагменты нуклеиновых кислот, причём в случае того, если этот процесс происходит в живых организмах, то они являются фрагментами рнк, а не днк, но в чем их особенность? Их?

120: Особенность заключается в том, что они соединяются в специфических участках, они соединяются с материнской.

121: Молекулы днк. Почему это происходит? Потому что они комплементарны. То есть они имеют такую последовательность нуклеотидов, которая комплементарна последовательности нуклеотидов на материнской цепочке днк. Вспомните правило черга.

122: Аденин соответствует тимину, а гуанин цитозину. То есть вот этот праймер сел на молекулу днк. Так что если, например, здесь находится Аденин,

123: На этом конце Аденин, то на этом, соответственно, находится Тимин, а если здесь находится, например, гуанин,

124: То здесь находится цитозин, то есть по другому этот праймер на другой участок, этот праймер сесть не может. И вот именно начиная с него, именно начиная от этого праймера, и начинается синтез.

125: Далее цепочки днк, то есть они являются необходимыми участниками процесса полимеризации. Очевидно, что для того, чтобы синтезировалась лидирующая цепь этого праймера, достаточно 1 и

126: От него дальше эта цепь просто напросто наращивается для того, чтобы синтезировалась запаздывающая цепь этих праймеров должно быть много, и, начиная от них, синтезируются фрагменты, оказаки, которые потом соединяются и образуют.

127: Опаздывающую цепь. Тут возникает вопрос а неужели если мы с вами хотим воспроизвести вот этот процесс в искусственных условиях, то есть сделать копию молекулы днк, но только не в

128: Организме, а в пробирке. Неужели для этого необходимо всех этих участников собрать в 1 месте и в 1 время? А ведь на самом деле полимеразная цепная реакция это по сути своей воспроизведение процесса аппликаци.

129: Но не в живом организме, а в пробирке. На самом деле сложность, на самом деле сложность процесса репликации в случае живого организма, да, обусловлена именно.

130: Особенностью нахождения днк в живой клетке. Но когда мы эти манипуляции хотим произвести уже в искусственной среде, то там несколько, все проще. И некоторые из этих участников там уже не нужны. Допустим, там уже оказываются не нужны.

131: Элементы, которые участвуют в изменении пространственной структуры днк, на самом деле там уже не образуются фрагменты, а казаки, соответственно,

132: Нет, и лигазы нет, и различных видов полимераза, н, полимераза там только 1. Тем не менее необходимые элементы, которые участвуют в эпликации, там тоже есть, там, безусловно, участ.

133: Для этого процесса нужны праймеры, для этого процесса, безусловно, нужны. Нужен фермент под названием полимераза и, конечно, структурные элементы. Кирпичики, молекулы, днк. То есть для того, чтобы получить молекулу днк, нужны нуклеотиды. Вот

134: По сути своей из этого процесса репликации, который происходит в живом организме. Далее мы с вами можем с собой взять полимеразу специфические праймеры и нуклеотиды, из которых в конечном итоге

135: Будет формироваться цепочка днк. На этом такой небольшой днквы ликбез мы с вами можем закончить. Я думаю, этого нам достаточно для того, чтобы понимать, как происходит сама полимеразная цепная реакция. И об этом мы

136: Поговорим уже в рамках следующего видеофрагмента. На этом я завершаю. Спасибо вам.